错配修复基因

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错配修复基因是在遗传性非息肉性大肠癌(HNPPC)中分离到的一组遗传易感基因,该系统任一基因突变,都会导致细胞错配修复功能缺陷,结果产生遗传不稳定,表现为复制错误或微卫星不稳定,因而容易发生肿瘤。
中文名
错配修复基因
概    述
错配修复基因是在
研究进展
错配修复基因hMLH1的发
检    测
1993年Ionow和Aaltonen等

错配修复基因研究进展

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错配修复基因1.11、错配修复基因hMLH1的发现

大肠杆菌mutS同源的hMSH2之后的MMR家族中的又一个错配基因的发现。该基因定位于3p21,是细菌错配修复基因mutl的同源物,与大约30%的HNPCC有关,hMLH1的cDNA全长2484 hp,编码长度为2268bp的开读框架,hMLH1蛋白由756个氨基酸残基组成,与酵母错配修复基因hMLH1比较有41%的同源性,hMLH1在结直肠癌中可能起着一种看家基因的作用。在部分HNPCC患者中hMLH1基因在第4l位密码子有一个C—T 突变,使相应的氨基酸残基由丝氨酸变成苯丙氨酸。另外,在HNPCC的患者中还检测到了第578至632位密码子之间的杂合性缺失及从第727位密码子的第一个核苷酸开始的4个核苷酸的缺失,在另外一些病例的第519位密码子则存在一个T的插入,造成hMLH1蛋白产物的羧基端238个氨基酸残基的缺失。另外,张晓梅等在结直肠癌患者的体细胞中发现了位于hMLH1基因第ll5l位碱基T—A的杂合型颠换,导致其第384位编码氨基酸由缬氨酸(Va1)突变为天冬氨酸(Asp),随后的研究结果表明,Va1384Asp作为东亚人hMLH1基因上的一个多态位点。

错配修复基因1.33、MMR基因hMLH1的检测

1993年Ionow和Aaltonen等发现,在几乎所有的HNPCC肿瘤和约12%~15%的散发性CRC中存在着微卫星上的突变,称作微卫星不稳定性(microsatelliteinstability,MSI),由此提出了另一条崭新的途径——错配修复途径。它的基本原理是MMR基因保证了DNA复制的高度保真,一旦MMR基因发生突变或启动子甲基化引起错配修复基因失活,导致机体错配修复功能的降低,进而导致整个基因组的不稳定,MMR功能缺陷的表现型是高度的微卫星不稳定(MSIH),又称之为复制错误(repliationerror,RER)阳性,从而使某些癌基因和抑癌基因的突变在体内得到快速聚集,肿瘤由此发生,表现为肿瘤细胞的DNA多为二倍体或近二倍体的含量,在此途径中,hMLH1和hMSH2这两个MMR基因起主要作用。RER阳性的散发性CRC与RER阴性者相比,具有不同的临床病理、分子生物学特征,表现为:发病年龄较轻;多位于近端结肠,且易伴发肠内或肠外其他器官的多发性肿瘤;对某些化疗药物(如5-FU、顺铂等)有原发性耐药;肿瘤细胞DNA多为二倍体或近二倍体;低分化腺癌、黏液腺癌及印戒细胞癌多见,但较少发生淋巴结转移,生物学行为较好。近年研究发现,hMLH1蛋白的表达变化结果可以很好地预示MMR功能缺陷的存在。
DNA错配修复基因(DNA mismatch repair gene)首先在细菌和酵母中发现,在人类基因组中也存在类似物。这种基因的突变在人类遗传性非息肉型结直肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)和散发性结直肠癌(Sporadic Col orectal Cancer,SCRC)的发病过程中起重要作用。DNA错配修复基因既非癌基因,也非抑癌基因,是另一类肿瘤相关基因,这是继癌基因与抑癌基因之后,在肿瘤发病的分子机制方面的又一重大进展。错配修复基因(MMR)是一类和人类的错配修复反应有关的基因,包括hMSH2、hMLH1、hMSH3、hMSH6、hPMSH1和hPMSH2等基因。其中,又以hMSH2为尤为重要。

错配修复基因与结直肠癌的关系

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错配修复基因2.11、hMSH2基因结构和功能

核苷酸错配发生于三种情况:即DNA的物理损伤、DNA复制过程中核苷酸的错误掺入以及基因重组。DNA聚合酶偶尔能催化不能与模板形成氢键的错误碱基的掺入,这种复制错误通常由聚合酶3′~5′的校对功能立即予以纠正,再开始下一个核苷酸的聚合反应。在某些特殊条件下,DNA聚合酶将极少的错误碱基遗留在DNA链上而未予以纠正,因此,DNA的错误修复必须有MMRS参与,它在修复过程中高度特异的识别错配碱基,并在此基础上对其进行双向切出,此时同样也依赖于DNA复制时模板链和新生链的甲基化程度的差异。错配修复反应既可修复DNA复制过程中出现的碱基错配,又可消除由于含简单重复序列的同源序列间遗传重组出现的不配对序列,这样可有效的防止DNA复制差错的产生。
在DNA错配修复中,hMSH2蛋白质首先与G-T结合(G-T Binding Protein,GTBP)形成一种称为hMSH2 α二聚体复合物,并结合到DNA碱基错配区,然后与hMSH1和hPSH2基因形成的二聚体hMut L α结合,其中异源二聚体hMutL α起到识别带有缺口的新生DNA链的作用。hMut L α与hMut S α结合到DNA错配区后,即可激活与Mut H蛋白有关的GATC核酸内切酶,这种酶可切出未修饰的甲基化GATC序列。依赖于Mut S、Mut L及DNA解旋酶(Mut U)的协同作用,随着新生链错配区的切出,整个修复反应即被启动。总之,修复反应包括切出含碱基错配区的DNA,被切出区域的重新合成以及连接等三个步骤。

错配修复基因2.22、hMSH2基因在结直肠肿瘤中的突变

根据MSI检出位点的多少,可将散发性结直肠癌分为高频率MSI(MSI H),低频率MSI(MSI L)和无MSI(MSS),MSI H结直肠癌表现为高频率的TGF-βRⅡ、IGF-ⅡR、BAX、hMSH3基因的移码突变和低频率的APC、MCC和DCC的杂合丢失,而MSI L和MSS结直肠癌却表现为相反结果。最近研究发现,除上述基因改变外,MSI H结直肠癌还表现为错配修复基因hMSH2和hMLH1错配修复基因表达的下调等,而MSI L和MSS结直肠癌则无此表现。在MSI的临床表型方面,MSI H多见于结直肠多发癌,多位于右半结肠,组织学上多为低分化型,少有淋巴结转移,多数认为恶性程度较低,预后较好。以上说明MSI H散发性结直肠癌无论在临床病理特点还是在基因改变方面均与MSI L和MSS癌有明显不同。
在散发性结肠癌患者细胞中检测到有DNA复制差错阳性(RER+)的出现,一般散发性结肠癌患者DNA中RER阳性检出率约为10%~16%,并且在一些具有微卫星DNA不稳定的散发性结肠癌患者细胞中亦筛查出有MMR基因突变的存在。Thibodeau等用位于染色体5、8、15、17、18上11个微卫星位点测508例SCRC(MSI30%为重度RER+),结果:重度RER+SCRC为16.1%,轻度RER+为21.3%,RER-SCRC为62.4%。分析RER+表型与患者临床病理特征的关系,轻度RER+SCRC患者其临床病理特征与RER-SCRC患者相似;重度RER+SCRC与其他两型相比,肿瘤患者多为女性,肿瘤多位于近段结肠、为二倍体肿瘤、发病年龄较低及多处于Ducks分期的后期。对其中188例SCRC用免疫组化技术研究hMSH2,hMLH1表达情况,结果显示,RER-SCRC(129/188)及轻度RER+SCRC(17/188),hMSH2,hMLH1蛋白表达均正常,42例重度RER+SCRC中,38(90%)例hMSH2正常,而缺乏hMLH1表达,2例正常表达,仅2例hMSH2不表达,认为hMSH2表达异常在重度RER+SCRC的发病机制中起重要作用。
2.2 HNPCC 是一种特殊类型的结直肠癌,是由于DNA错配修复基因(MMR)发生胚系突变所致的一种单基因的显性遗传性疾病,又称Lynch综合征,约占结直肠癌总数的15% ~18%。本病约占家族性结直肠癌的50%,采用阿姆斯特丹标准后,占全部结直肠癌的1%~5%。国内报道发生率占同期收治结直肠癌病例的2.4%。HNPCC以男性多见,男女之比约为2.5∶1。HNPCC是一种常染色体显性遗传性疾病,外显率高达80%~85%。1993年Aaltonen等首先研究发现,遗传性非息肉性结直肠癌中存在一种DNA错配修复基因,该基因的改变可引起微卫星不稳定性(MI)。现在已分离和鉴定的与HNPCC有关的基因主要有hMSH2、hMLH1、hPMS1和hPMS2,他们分别定位于染色体2p21-22、3p21、2q31-33和7p22。目前已检测到hMSH2的突变为MMR中最易检测的突变,其突变检出率为21%~54%。这种突变主要为单碱基的改变和由于碱基的缺失和插入引起的移码突变,导致下游提前出现终止密码,而使蛋白截断或功能缺失。hMSH2的突变主要位于其后面的外显子上。研究证明,在HNPCC发病中起主要作用的是hMSH2和hMLH1基因,大约半数的HNPCC可检出hMSH2或hMLH1基因突变。国内王亚平等分析了HNPCC患者外周血细胞DNA错配修复基因hMSH2、hMLH1的突变,并证实了HNPCC的发生与错配修复基因的突变密切相关。袁瑛等分析了29个HNPCC家系中,hMSH2基因的突变明显高于对照组。hPMS1和hPMS2是细菌错配修复基因mut L的同源物,分别定位于2q31~33和7p22,各包含一个2795bp和2586bp的开读框架。
当一个家族所具备的临床病理特点越多,发生HNPCC的可能性越大。再此应强调的是,要重视MMR基因检测在诊断中的作用,即使只具有一个特点的家系也是如此。如果一个家系具有三项特点以上,或一个家系有3人具有特点,即为HNPCC高危家系,应进一步进行MMR基因突变分析。由于突变分析技术要求较高,操作比较繁杂,花费也大,因此如何选择基因分析的病例就显得非常必要。一般认为,对低危家系的结直肠癌先行MSI检测,然后再对MSI+病例进行突变分析。
2.3 结直肠腺瘤和溃疡性结肠炎相关性结直肠癌 MMR基因的突变导致MMR系统的缺陷,可引起广泛的体细胞突变和DNA复制错误,MMR功能缺失也可导致一些抑癌基因突变率的增加和突变的积累而促进肿瘤的发生。周琪等发现hMSH2基因蛋白阳性表达率从正常组织、腺瘤不典型增生、腺瘤癌变到腺癌逐渐降低,提示在腺瘤阶段已经有MMR的基因的突变或功能异常,并随其恶性程度的增加,MMR基因的突变频率也逐渐升高。提示MMR基因的突变,尤其是hMSH2的突变可能是结直肠癌发生的早期事件之一。结直肠腺瘤不但在HNPCC中发生,而且有很多证据说明HNPCC即发生于腺瘤基础上。HNPCC相关腺瘤与其他腺瘤有明显不同,可以是单发,也可以是多发,组织学上多为绒毛状腺瘤,常表现为明显的异型性,可迅速由腺瘤发展为腺癌,因此亦称为侵袭性腺瘤(aggressive adenoma)。有关分子生物学研究亦支持HNPCC相关腺瘤具有侵袭性的观点。大部分HNPCC腺瘤存在基因不稳定性,检测腺瘤MSI是发现HNPCC的有用方法。由于近来HNPCC有关基因的鉴定,我们可对基因携带者进行分子遗传学诊断,这将使高危人群的数量减少一半。Russell等发现错配修复缺陷造成的微卫星DNA重复序列数不稳定与HNPCC由腺瘤向癌恶性转变有关。腺瘤阶段,微卫星DNA重复序列数改变的比例明显低于癌阶段。这说明大多数HNPCC在良性的腺瘤阶段已有部分基因向不稳定发展,微卫星DNA重复序列数改变速率越快,腺瘤恶变的可能性就越大。
溃疡性结肠炎个体结直肠癌发生率比一般人群高20倍。Kern等证明微卫星DNA重复序列数的不稳定在溃疡性结肠炎的异形区和结肠癌细胞中都存在。人类hMSH2基因中一个内含子剪接位点的碱基T被C替代后,会大大增加8年以上溃疡性结肠炎患者癌变的可能性。Cawkwell等在38例UCACRC中发现,有1例(2. 4%)存在hMSH2蛋白表达缺失,该例亦表现高水平的MSI。王赫等在研究中发现, 溃疡性结肠炎相关性结直肠癌(UCACRC)组织中hMSH2蛋白的缺失率很高,为50%(4/8)。尽管在溃疡性结肠炎伴不典型增生(UD)组织中hMSH2蛋白的缺失率为0,但有4例(1例为重度不典型增生,3例为中度) hMSH2蛋白的表达强度很弱,提示在UCACRC癌前病变组织中可能有hMSH2基因转录水平的下降,从而影响hMSH2蛋白的表达,使之不能充分发挥其修复错配DNA的功能,产生DNA复制错误,导致基因变异,癌基因激活或抑癌基因失活,组织发生癌变。目前UCACRC的发生发展过程中的分子生物学变化仍不清楚,还需要进一步研究和探索。

错配修复基因2.33、hMSH2基因前景与问题

直肠癌基因诊断的工作中,一般多将肿瘤细胞微卫星DNA不稳定检测作为错配修复基因(主要包括hMSH2、hMLH1)遗传性突变分析的初筛指标。由于结直肠癌的发生与错配修复基因密切相关,且错配修复基因异常者患结直肠癌的危险性明显增高,因此,对结直肠癌集中的家族进行错配修复基因检测可以确定致癌的风险性从而采取相应的措施,以便早期发现、早期治疗肿瘤,可望达到降低病死率、提高生存率的目的。目前已经对包括hMSH2在内的MMR基因缺陷与结直肠癌发生的关系有了深入的研究,仍有些问题期待解决如:MMR基因与癌基因与抑癌基因之间的相互关系;MMR基因缺陷影响细胞调亡的信号转导与机制尚不明了等。 错配修复的缺陷和复制旁路的强化是顺铂/卡铂耐药的主要机制;奥沙利铂(乐沙定)目前的基础研究发现,与顺铂不同的是错配修复系统缺陷和复制旁路强化不会影响奥沙利铂(乐沙定)的细胞毒性克服了这种耐药,因此奥沙利铂(乐沙定)具有更广泛的抗瘤活性。